Autori: 
Michael Hawkins
Nicole Clark
Pedro Echave
William Law

I microRNA (miRNA) sono RNA non codificanti lunghi 18-22 nucleotidi che svolgono un ruolo importante nella regolazione dei livelli proteici. 
Molti studi recenti hanno proposto l'uso dei miRNA come biomarcatori perché sono specifici per i tessuti, stabili nello spazio extracellulare e i loro profili di espressione possono essere collegati allo stato di salute. Possono essere rilevati in modo affidabile nei tessuti e nei diversi fluidi corporei, tra cui plasma, siero e urina. Negli ultimi anni i ricercatori interessati ai miRNA si stanno spostando dallo studio dei tessuti a quello dei fluidi corporei in quanto si tratta di campioni ottenibili facilmente e in modo non invasivo. Tuttavia, con questi materiali di partenza, l'input disponibile è basso e spesso vicino a 1 ng. 

Il kit NEXTFLEX® Small RNA-Seq v3 è stato utilizzato con successo per studiare i miRNA in diversi tipi di fluidi corporei. Tuttavia, a causa delle basse quantità di input, il flusso di lavoro richiedeva la purificazione mediante PAGE per separare i dimeri adattatori dal prodotto finale della libreria.

Il kit NEXTFLEX® Small RNA-Seq v4 permette di utilizzare bassi input senza ricorrere alla purificazione tramite passaggio su gel per separare i dimeri adattatori dal prodotto finale della libreria. La tecnologia di questo kit premette un flusso di lavoro semplificato e la riduzione dei bias. La reazione di ligazione è stata ottimizzata, sono stati aggiunti oligonucleotidi per la deplezione degli adattatori e le estremità randomizzate degli adattatori sono state rimosse.

Flusso di lavoro del kit NEXTFLEX® small RNA-seq v4:

Confronto tra il kit NEXTFLEX® Small RNA-seq v4 e il Competitor A 
Abbiamo effettuato un confronto tra il kit NEXTFLEX® Small RNA-Seq v4 e il Competitor A, che offre anch'esso un flusso di lavoro senza gel anche a partire da 1 ng. 
Per farlo, abbiamo selezionato il siero come campione di partenza. Il siero è un campione complesso per le procedure di small RNA-seq contenenti una bassa percentuale di letture appartenenti al gruppo dei miRNA. Inoltre, i campioni di siero hanno naturalmente un contenuto variabile di miRNA e sono comuni anche notevoli differenze tra diversi donatori. 
Cinque campioni di siero umano (Zenbio) sono stati estratti utilizzando il kit NextPrep™ Magnazol™ cfRNA isolation di Revvity. 
L'RNA ottenuto è stato quantificato con il fluorometro Qubit® di Thermo Fisher® Scientific. 
1 ng di RNA totale è stato utilizzato come input sia per il kit NEXTFLEX® Small RNA-Seq v4 sia per il Competitor A. 
Due diversi tecnici hanno eseguito l'esperimento per valutarne la riproducibilità.
Le librerie di small RNA sono state preparate manualmente secondo le istruzioni del produttore e, dopo la misurazione con il fluorometro Qubit® di Thermo Fisher® Scientific e il successivo pooling, sono state processate su una piattaforma Illumina® MiSeq® con lunghezza di lettura 1x75 bp. 
L'analisi degli small RNA è stata effettuata utilizzando uno script personalizzato di Revvity. Il riferimento per l'allineamento era costituito da miRNA maturi provenienti da mirBase v22.1.

Allineamento dei miRNA. 
Dopo il filtraggio e la mappatura dei dati, abbiamo controllato la percentuale di letture che si allineavano con il dimero adattatore, tRNA, YRNA, rRNA e miRNA per entrambi i kit (Figura 1).
Entrambi i kit mostrano una bassa percentuale di dimero adattatore o rRNA nei dati finali. 
Le librerie del Competitor A mostrano una maggiore presenza di letture corrispondenti a tRNA e YRNA, suggerendo che il meccanismo per bypassare queste molecole è meno efficiente. 
Entrambi i kit presentano una percentuale di letture di miRNA in accordo con i dati pubblicati per il siero, anche se il tasso di mappatura del miRNA del NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v4 è stato 2 volte superiore a quello ottenuto con il Competitor A (15,61% contro 7,15%).

Figura 1. Proporzione di letture allineate al dimero di adattatore e a diverse specie di RNA. 

Ricerca di miRNA
Le prestazioni del sequenziamento di small RNA dipendono fortemente dal flusso di lavoro utilizzato. Per comprendere la relazione tra le specie di miRNA identificate da entrambi i kit, abbiamo quantificato quante specie sono state trovate e le somiglianze tra i miRNA scoperti in entrambi i flussi di lavoro. Per farlo abbiamo prima analizzato il numero medio di miRNA univoci scoperti per campione (Figura 2).

Figura 2. Numero medio di miRNA univoci determinati per campione utilizzando 1 ng di siero come input.

Abbiamo riscontrato che il NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v4 ha un tasso di determinazione dei miRNA maggiore rispetto al Competitor A. Impostando una soglia di 5 (almeno 5 conteggi per considerare un miRNA specifico), la media di miRNA univoci trovati per campione è 163 contro 117, ovvero il 39% in più. Se la soglia è più rigorosa, per esempio 10, allora il NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v4 può determinarne 128 contro 90, ovvero il 42% in più di miRNA univoci rispetto al Competitor A. Per investigare quanto fossero comparabili i set di miRNA trovati da entrambi i workflow, abbiamo impostato la soglia a 5 e determinato i miRNA in comune tra le repliche di ciascun kit. Questo ha portato a 134 miRNA per il NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v4 e 92 per il Competitor A. (Figura 3).

Figura 3. Diagramma di Venn che mostra il 45% in più di miRNA identificato utilizzando il kit NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v4 rispetto al kit del Competitor A. 81 miRNA (88% dei miRNA scoperti dal Competitor A) sono stati trovati da entrambi i kit. 11 miRNA trovati solo con il Competitor A e 53 miRNA trovati solo con il NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v4.

Conclusione
Il NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v4 ha un flusso di lavoro semplice, senza passaggio su gel, che offre tassi eccezionali di mappatura e identificazione dei miRNA anche quando si lavora con input bassi e campioni difficili come il siero.